アヒル絨毯及びガチョウ絨毯製品の蛍光PCR鑑定方法の採用

　　1はじめに

　　ダウンガチョウ、アヒルの腹部に生えた蘆の花狀の綿毛を指し、羽毛、綿、羊毛、シルクの4大天然保溫材の中で羽毛の保溫性能が最も優れている動物性タンパク質繊維である[1]。しかし、現在市場における羽毛製品の価格は高低差が大きく、多くの羽毛製品に偽物が混入している[2-3]?，F段階では、羽毛市場には劣悪な原料を用いて偽ったり、表示されているダウン充填量が実際と合わなかったり、ふわふわ度が不合格だったり、清潔度が不合格だったりする問題がある[4]。その中でよく見られる劣悪な原料を用いた偽った方法は、アクリル綿から作られた偽の羽毛製品、原毛を用いたダウン製品、粉砕ダウン（フライフィラメント）を用いたダウン製品[5]。

検査業界において、羽毛の鑑定は主に國家標準GB/T 10288-2003「羽毛羽毛検査方法」及び業界標準FZ/T 80001-2002「水洗い羽毛試験方法」に基づいて提供された方法であり、この方法は光學顕微鏡を通じて、肉眼でサンプルの顕微鏡構造を観察し、そして比較標準における羽毛、ガチョウの綿毛や他の鳥の綿毛の微細な特徴の文字記述と図示を分類して鑑定した。この方法は検査員に対する要求が高く、主観性が大きく、誤審が生じやすく、使用する見取り図と文字の記述が簡単で、実物標本參照が不足し、実際の検査作業に困難をもたらした[6]。

そこで、本研究はアヒルの綿毛及びビロード製品の蛍光PCR鑑定方法を用いて、伝統的な鑑定方法と結合し、羽毛鑑定の客観性と精度を高めることを期待している。

　　2材料と方法

2.1材料と試薬

2.1.1試験材料

試験に用いたアヒルの綿毛、ガチョウの綿毛などの製品は市場から購入した。

2.1.2試薬

イソチオシアネート、ポリビニルピロリドンK-40（PVP K-40）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、β-メルカプトエタノールはAmersco社製品、サケ精DNAはSigma社製品、Taq酵素及び2×premexExTaq酵素は寶生物工學（大連）有限公司から購入し、プライマー及びプローブ（表1）は上海生工生物工學技術サービス有限公司から合成した。

2.2方法

2.2.1 DNA抽出

毛包付き羽毛を採取し、毛包部位約0.03 gのサンプルを切り取り、3 mL 2%SDS溶液[2%SDS、50 mmol/L Tris?Cl（pH値8.0）、20 mmol/L EDTA（pH値8.0）]、65℃水浴1.5 hを加え、時々振動した、12000 r/min遠心分離5 min、上清を取る、3 mL羊毛抽出液[4 mol/Lイソチオシアン酸グアニジン、0.3 mol/L塩化ナトリウム、4%PVPK-40、50 mmol/L Tris?Cl（pH値8.0）、20 mmol/L EDTA（pH値8.0）]及び60μLβ-メルカプトエタノールを加え、65℃水浴4.5 h、時々振動した、12000 r/min遠心5 min、上清を採取し、等體積フェノールを添加する：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）、逆さまに混合し、12000 r/min遠心10 min、上清を採取し、1μL 10 mg/mL鮭精DNA、1/10體積の3 mol/L酢酸ナトリウム（pH値5.2）及び等體積イソプロパノールを添加し、?20℃で一晩沈殿し、12000 r/min遠心分離15 minで沈殿を収集した、上清を丁寧に注ぎ、70%エタノールで2回洗浄し、風乾する。50μLの脫イオン水を取って溶解沈殿した。

2.2.2蛍光PCR検査システムの構築

2.2.2.1アヒル毛、ガチョウ毛の特異的蛍光プライマーの設計

アヒル、アヒル、マガモ、マガモ、ガチョウ、ガン、鶏、ドバト、ウズラ、北米七面鳥のミトコンドリア12 SrDNA全遺伝子配列に基づいてプライマーとプローブを設計し、プライマーとプローブの特異性を考慮した上で、プライマーとプローブの結合部位で、アヒルとその祖先種の緑頭アヒルとマガモの配列が一致し、ガチョウとその祖先種のガンの配列が一致することを保証した。

　　2.2.2.2蛍光PCR増幅及び結果判斷

反応系（20μL）：2×premix Ex Taq 10μL、上下流プライマー各0.2μmol/L、プローブ0.1μmol/L、テンプレートDNA 4μL。反応手順：95℃30 s、95℃5 s、60℃34 s、40サイクル。結果判斷：Ct値≦35の場合、結果は陽性と判定でき、Ct値>35の場合、結果は陰性と判定することができる。

2.2.2.3方法の特異性と検出限界試験

抽出したアヒル、アヒル、アヒルの綿毛、ガチョウ、ガチョウの綿毛、鶏、ウズラ、家牛、水牛、豚、羊、ヤギ、馬、ウサギ、マウス、サケ精DNAを増幅テンプレートとし、アヒルの綿毛、ガチョウの綿毛の特異的プライマーとプローブを用いて蛍光PCR反応を行い、方法の特異性を検証する。そして、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pgのテンプレートで蛍光PCR反応を行い、方法の検出限界を測定し、勾配ごとに3つの平行を作る。

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2.2.3サンプル検査

18個のアヒル毛製品を選択し、1.2.1の手順でDNAを抽出し、2.2.2に従って蛍光PCR反応を行い、使用したサンプルを表2に示した。ビロード製品は比較的に少ないため、市場ではビロード製品は購入できず、サンプル試験にはビロード製品は含まれていない。

　　3結果

3.1アヒル毛及びガチョウ毛製品のDNA抽出方法の確立アヒル毛及びガチョウ毛製品が肉眼で明らかな毛嚢を含むため、試験中にアヒル毛及びガチョウ毛嚢の部位を切り取り、SDS-イソチオシアネート-β-疎基エタノール法を用いてアヒル毛及びガチョウ毛DNAを抽出する。抽出されたDNA濃度は20 ng?200 ngに達し、蛍光PCR反応を行った時のアヒル毛DNA及びガチョウ毛DNAのCt値はそれぞれ25と26であり（図1）、この方法を用いて抽出されたDNA品質は蛍光PCRの要求を満たすことを表明した。

3.2方法特異性試験結果

その結果、アヒルの毛の特異性蛍光プライマーはアヒル、アヒルの毛、アヒルの毛のDNAを増幅することができ、他の種のDNAと非特異的に増幅することができ、ガチョウ毛の特異的蛍光プライマーはガチョウとガチョウ毛のDNAを増幅するだけで、他の種のDNAと非特異的に増幅することができ、設計されたプライマーの特異性が良いことを示している。

3.3方法検出限界試験結果

結果、本方法を用いて100%アヒル絨毯原料及び100%ガチョウ絨毯原料DNAを抽出して蛍光PCR反応を行った場合、DNA検出限界は10 ng（サケ精DNAを含む）であった。

3.4サンプル検査試験結果

検査結果により、18個のアヒル毛サンプルはすべてアヒルDNA成分を検出でき、ガチョウDNA成分は検出されず、検査結果は製品の明示成分と一致した（表1）。単獨でアヒルの特異性プライマーとアヒルの特異性プライマーを用いて蛍光PCR反応を行い、18個のサンプルはすべてアヒルのDNA成分を検出し、アヒルのDNA成分を検出しなかった、18個のアヒルの絨毯製品はすべてアヒルの絨毯から來たことを表明した。

　4ディスカッション

動物繊維中のDNAは主に毛嚢部位に存在し、毛幹中にも少量のミトコンドリアDNAが存在している[8]。羽毛製品は肉眼で見える毛嚢を含んでいるため、試験過程で毛嚢部位を重點的に採取し、SDS-イソチオ水素酸グアニジン-β-メルカプトエタノールDNA抽出法[7]を用いてDNA抽出を行った場合、羽毛毛嚢部位は基本的に溶解し、毛幹は広範囲に破斷し、サンプル検査試験を通じて、この方法はアヒルの綿毛とガチョウの綿毛のDNAを抽出することに成功することを表明した。

本試験ではミトコンドリア16 S rDNA遺伝子配列をプライマー設計ターゲット部位として選択し、プライマー設計時には、設計されたプライマーが全世界の異なるアヒルガチョウ品種系をカバーできることを考慮しなければならない。理論的には、アヒル、ガチョウとその祖先種の分化時間はアヒル、ガチョウの各品種の分化時間より長いため、あるDNA配列がガチョウとその祖先種の中で保守的であれば、すべての馴化品系の中で保守的であることを保証することができ、それによって理論的にこのプライマーがすべてのガチョウ品種の羽毛製品を検査することができることを保証する。ウィキペディアや関連文獻の記事[9-10]によると、イボ鼻棲鴨（Cairina moscata、通稱マガモ）のほか、カモはハガモ屬の中のアオガモ（Anas Platyrhynchos）とマダラノハシガモ（A.poecilorhyncha）が起源で、マガモは中南米から導入されたアヒル種である。ガチョウは雁類の野鳥が人間の長期的な馴化によって形成され、その中で中國

ガチョウは鴻雁（Anser cygnoides）によって飼いならされ、ヨーロッパのガチョウは灰雁（A.anser）によって飼いならされた。そのため、アヒル、アヒル、ガチョウとその祖先種をダウンロードし、同時に類似品種をダウンロードしてプライマー設計を行い、設計したプライマーはNCBIデータベースBLAST照合及び特異性試験を通じて、特異性が良いことを表明した。

羽毛繊維の種類の鑑定は現在、主に顕微鏡法に頼っており、この方法は操作が簡単であるが、試験者の素質と経験に頼りすぎて、主観性が強すぎて、本研究開発の方法は伝統的な顕微鏡鑑定方法の有力な補助として、羽毛鑑定の客観性と正確性をさらに高めることができる。